• Tom Holland vai Peter Parker / Người Nhện: Học sinh trường trung học Midtown School of Science and Technology ở Queens, New York.[6] Cậu sở hữu những khả năng của loài nhện sau khi bị một con nhện biến đổi gen cắn.[6]
• Samuel L. Jackson vai Nick Fury: Cựu giám đốc của tổ chức S.H.I.E.L.D.[21]
• Cobie Smulders vai Maria Hill: Cựu đặc vụ của S.H.I.E.L.D, đồng thời là cánh tay phải của Nick Fury.[21]
• Zendaya vai Michelle "MJ" Jones: Bạn cùng lớp và là bạn gái của Peter Parker.[22]
• Jacob Batalon vai Ned Leeds: Bạn thân của Peter Parker, đồng thời là bạn học đầu tiên của Peter biết cậu là Người Nhện.[23][24]
• J. B. Smoove vai thầy Dell: Giáo viên của Peter Parker, người đồng hành cùng với lớp của Peter trong chuyến đi du lịch ở châu Âu.[25][26]
• Martin Starr vai Roger Harrington: Giáo viên của Peter Parker, người đồng hành cùng với lớp của Peter trong chuyến đi du lịch ở châu Âu.[25][27]
• Marisa Tomei vai May Parker: Dì của Peter Parker, người duy nhất trong gia đình Peter biết cậu là Người Nhện và muốn cậu tiếp tục làm Người Nhện để giúp bà trong các hoạt động từ thiện.[25][28][29]
• Jon Favreau vai Harold "Happy" Hogan: Cựu giám đốc lực lượng an ninh của tập đoàn Stark Industries, tài xế và vệ sĩ của Tony Stark, đồng thời là người trông nom Peter Parker.[30]
• Jake Gyllenhaal vai Quentin Beck / Mysterio: Một chuyên gia kỹ xảo bị sa thải khỏi Tập đoàn Công nghiệp Stark, tự xưng là siêu anh hùng đến từ một vũ trụ khác, được Nick Fury cử đến để hợp tác với Peter Parker trong việc ngăn chặn nhóm Elementals - nhóm kẻ thù mang sức mạnh của 4 nguyên tố (đất, nước, lửa và không khí).[31][32][33]

Bộ phim còn có sự góp mặt của J.K. Simmons vai J. Jonah Jameson, khiến ông trở thành diễn viên đầu tiên đóng cùng một vai trong và ngoài MCU.